Protein Hamburg

Eiweiß Hamburg

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Doppeldüse schont Proteinkristalle

Mit einer neuartigen Einspritzdüse wird der Verzehr von wertvollen Proteinkristallen in der Kristallografie verringert und das Einsatzspektrum dieser weit verbreitetsten Analysenmethode ausgeweitet. Dank dieses innovativen Konzepts kommt die Serien-Röntgenkristallografie, mit der die Raumstruktur von Eiweißen atomar genau bestimmt werden kann, mit bis zu achtmal weniger Kristall aus, wie die Forscher um den DESY-Wissenschaftler Dr. Sa?a Bajt vom Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) in der Fachzeitschrift "Scientific Reports" ausweisen.

Anhand ihrer DÃ??se haben die Wissenschaftler bisher nicht gekannte Einzelheiten in der Zusammensetzung des Enzyms? In der Biologie interessiert die Raumstruktur von Eiweißen, weil sie viel über die exakte Funktion dieser Moleküle aussagt. Dazu wird aus den zu prüfenden Eiweißen ein kleiner Kristallkörper gezogen und mit Röntgenstrahlen bestrahlt.

Die Röntgenstrahlung wird am Gitter verteilt und generiert ein typisches Streuungsmuster, aus dem die Raumstruktur des Kristalles und damit des Eiweißes selbst berechnet werden kann. Viele Eiweiße wollen jedoch nicht in die kristalline Form gezwungen werden, weil dies ihrem Naturzustand zuwiderläuft. "Die Züchtung von Proteinkristallen ist aufwändig, oft können nur wenige Millionstel eines Gramms und kleinste Kristallstrukturen hergestellt werden", erklärt Dr. Dominik Oberthür von DESY, leitender Autor der Wissenschaft.

Auch mit den äußerst lichtstarken Lichtblitzen so genannter Röntgenlaser (XFEL) können selbst solche kleinen Quarze noch analysiert werden, doch für die Bestimmung der Eiweißstruktur sind meist mehrere tausend Streumuster erforderlich. Doch da die sensiblen Microkristalle im starken X-Ray-Blitz verdunsten, nachdem sie ihr Streuungsmuster generiert haben, wird ein konstanter Lichtstrahl aus frischen Microkristallen durch den Impulslaser gesprüht.

Dieser Begriff wird als Serien-Röntgenkristallografie bezeichnet und hat die Untersuchung von zahlreichen Proteinen erlaubt, die bisher nicht untersucht werden konnten. Außerdem wird nur ein kleiner Teil der Quarze im Lichtstrahl wirklich von einem Elektronenblitz erfasst - abhängig von der Strahlgeometrie und den technologischen Kenngrößen des Laserstrahls. "Denn je weniger Kristall, umso weniger Eiweißmaterial wird benötigt, umso einfacher ist die Analyse", sagt Oberthür.

Deshalb hat das Dr. Sa?a Bayt Forschungsteam ein neues Verfahren namens Double-Flow Focusing Dozzle ( "DFFN") ausgearbeitet, eine Düse, die den Konsum von Proteinkristallen signifikant mindert. In der Regel werden die zu prüfenden Eiweißkristalle durch eine spezielle Düse in einer Trägermediumflüssigkeit, dem sogen. Die Düse befindet sich in der Nähe eines schnell fließenden Gasstromes, der die Flüssigkeit aufnimmt.

Damit ein stabiler Balken nicht zu kurz kommt, tropfen die meisten Eiweißkristalle unbenutzt in einen Sammelbehälter und werden vergeudet. Bei der neuen Doppelmundstückdüse wird der Jet nun aus Ethanol (Alkohol) gebildet. Nur in der Bildmitte dieses Ethanolstrahls wird ein feinster Lichtstrahl aus Eiweißkristallen eingespritzt.

Bildet einen standfesten Jet und transportiert die Proteinkristalle", erklärt Jürgen Kno?ka, Doktorand am CFEL der Uni Hamburg, der die Düse mitentwickelt hat. "Ethanol hat die idealen Voraussetzungen, um einen sehr beständigen Jet zu erzeugen, in dessen Mitte ein sehr dünner Kristallstrom durchströmt wird. Zudem kann der Feinstrom bei nanokristallinen Materialien exakt mit dem Dünnstrahl des Laserstrahls überlagert werden.

Dadurch wird nicht nur der Kristallanteil, sondern auch die Bildqualität des Streubildes erhöht. "Mit unserer Doppelfokusdüse können wir nicht nur den Verbrauch von Kristallen senken, sondern auch die Röntgenstrahlenquelle effektiver nutzen, indem wir die Geschwindigkeit der Aufnahme hochwertiger Bilder erhöhen", sagt Bajt. "Darüber hinaus erlaubt Äthanol als Strahlflüssigkeit die Analyse von Eiweißen, die noch nicht injizierbare Puffern erfordern.

"Bayts Arbeitsgruppe testete die neue DÃ??se am Röntgenlaser LCLS des US-amerikanischen Teilchenbeschleunigerzentrums SLAC in Kalifornien und arbeitete mit mehreren anderen Forschungsgruppen zusammen, um die Aufbauorganisation von Proteinen zu entschlÃ?sseln. "Gemeinsam mit der Arbeitsgruppe des Nobelpreisträgers Roger Kornberg von der Stanford University konnten wir erstmalig die Strukturen des Enzyms RNA-Polymerase II bei Zimmertemperatur entschlüsseln", erklärt Oberthür, da die Strukturanalytik bei Zimmertemperatur eine Grundvoraussetzung für die detaillierte Untersuchung der Baudynamik ist, eröffnen sich damit zeitaufgelöste Ermittlungen, sogenannte Molekularfilme, dieses bedeutenden Systems.

"Die Studie ergab einige bisher nicht bekannte Einzelheiten in der Zusammensetzung dieses Enzyms. Zwei weitere Fermente - eine Membran-gebundene Wasserstoffase und eine Dioxydase - und natürlich auftretende Protein-Nanokristalle aus dem Cocoon eines Spezialvirus (Cydia pomonella granulovirus, CpGV) wurden mit der Düse erforscht. Mit der Düse wurde auch ein weiteres Praxisproblem dieser Art der Proteininjektion gelöst: Eiweißkristalle und Puffermaterialien sowie Speiseeiskristalle sammelten sich meist am Rand von gewöhnlichen Spritzdüsen und im Sammelbehälter unter dem Spritzstrahl und wuchsen zu tropfsteinähnlichen Formationen heran.

Gelangen diese Protein-Eis-Stalaktiten und Stalagmiten in den Strahlengang, machen sie nicht nur die Streumuster nutzlos, ihre Reflexe können auch so stark sein, dass sie den Melder schädigen. Deshalb müssen solche Versuche regelmässig abgebrochen werden, um die Protein-Eis-Tropfsteine zu beseitigen. "Äthanol in unserer Spritzdüse vermeidet die Bildung solcher unerwünschter Strukturen und erlaubt stundenlange Versuchsbedingungen ", erklärt Oberthür, "die Spritzdüse hat bei allen Versuchen hervorragend funktioniert", so Bajt.

"Arizona State University, Cornell University, University of Minnesota, Technical University Berlin, Charité Hochschulmedizin Berlin, Hauptman-Woodward Medical Research Institute, University of Nova Gorica, Institute for Metals and Technology in Ljubljana, Helmholtz-Zentrum Geesthacht und Hamburg Center for Ultrafast Imaging waren ebenfalls an den Arbeiten beteiligt. 2.

Die CFEL ist eine Zusammenarbeit zwischen dem Deutschen Forschungszentrum (DESY), der Hamburger Uni und der Max-Planck-Gesellschaft. Das Projekt wird zu 90 Prozent von dem BMBF und zu 10 Prozent von den Bundesländern Hamburg und Brandenburg gefördert. Das Unternehmen entwirft, fertigt und vertreibt an seinen beiden Produktionsstandorten in Hamburg und Neuthen bei Berlin große Teilchenbeschleuniger und untersucht dabei die Strukturen der Materie. 2.

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